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寻找除单药法以外的精准肿瘤学研究方法

研究人员利用转录组揭示多种药物敏感的肿瘤生成路径

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简介

在总部位于美国南达科他州苏瀑的Avera Health精准肿瘤学中心,Brian Leyland-Jones(医学博士)以及他的团队开展了临床研究来对具有潜在诊断疾病可能的生物标记进行了鉴定、分析及验证,并报告癌治疗决策。与Leyland-Jones医生密切合作的是Brandon Young,他是加利福尼亚拉霍亚Bowden精准肿瘤学临床实验室分子和实验医学测序部门的主任。他们一起合作开展了DNA和RNA新一代测序(NGS)研究以及蛋白组学肿瘤分析,用于设计实验药物组合治疗。

他们的方法中,转录组要素至关重要。他们不想局限在匹配单个DNA突变与其相应药物的“传统”单药物治疗方法中?!耙蛭忠┪镒楹现瘟贫訦IV和结核病有效,所以我们认为三种药物组合药物组合的治疗对癌症可能也有效果,”Young先生这样说道?!巴ü齊NA测序(RNA-Seq),我们可以确定特定生物学通路是否参与其中,”Leyland-Jones医生补充道?!巴ü踊NA上升至已激活通路的转录组特征,我们可以更多地了解癌症内部蛋白水平实际正在发生什么变化?!?/p>

iCommunity与Leyland-Jones医生和Young先生进行了谈论,探讨了他们的研究目标、正在进行的RNA-Seq研究、以及他们对NGS在癌症医学中的未来愿景。

Brian Leyland-Jones(医学博士)是Avera Health的精准肿瘤学中心的肿瘤学专家/血液学专家,而Brandon Young是Bowden精准肿瘤学临床实验室分子和实验医学测序部门的主任。

问题:您研究的主要关注点是什么?

Brian Leyland-Jones (BLJ):肿瘤是克隆形成的,在肿瘤形成的每种细胞群之间具有克隆独立性。我们寻找的是能够关闭所有克隆驱动力三种或四种药物的组合。这是一项非常具有攻击力的方法。除Razelle Kurzrock医生(开发了美国最大的一期临床试验之一)以外1,大多数学术中心使用测序将受试者匹配到单药治疗研究。

Q:您为什么加入Avera Health?

BLJ:我团队的11位人员在2013年后期联系了Avera Health,看看他们是否看中我们的测序专业知识。我们希望有一个前沿的肿瘤学研究环境,并支持癌症受试者测序数据库的开发。现在我们已经对大约700个个体进行了测序。

Q:为什么您的测序实验室在圣迭戈,而不是Avera Health的总部南达科他州?

BLJ:我与Brandon Young合作已经快十年了。在南达科他州的一个挑战是在该区域招募专攻基因组和临床试验的专业人员非常难。但是,如果你在拉霍亚的平顶山工作,旁边就是Illumina、数以百计的生物技术公司以及加州大学圣迭戈分校、Scripps研究所、Salk研究所和Sanford Burnham Prebys医学研究所。我们在拉霍亚可以更好地与圣迭戈区域其他生物科技公司合作。全球创新网络(WIN)联盟也使用我们在拉霍亚的实验室作为其精准肿瘤学实验室的全球中心。

"我们采集相同的临床样本集,并在NextSeq 500系统上使用NanoString nCounter直接杂交技术比较RNA-Seq与TruSeq RNA Access。"

Q:对肿瘤RNA进行测序的价值是什么?

Brandon Young (BY):历来,DNA测序更容易执行。常规项目(如NCI-Match*和Stand Up To Cancer)旨在将单个DNA突变与单药物治疗联系起来。我们的多药物方法需要更多信息。我们需要从多种方法获得信息,以有效确定哪些药物可在组合中使用。

在癌症中有多个主要网络和通路。因为三种药物组合治疗对HIV和结核病有效,所以我们认为三种药物组合药物组合的治疗对癌症可能也有效果。通过RNA-Seq进行的表达谱分析,我们可以确定特定生物学通路(如在血管生成中的某个通路)是否上调并作为组合治疗法的潜在靶点。

找到一个DNA突变很可能还不够,因为它可能不是始终表达。因此,RNA-Seq可以告诉我们基于DNA分析的方法是否有用。指导性治疗针对融合,所以我们想要知道融合本身是否真的得到了表达。RNA-Seq为我们提供肿瘤生物学的完整信息,是一种非常有价值的工具。类似地,我们相信蛋白组学和蛋白磷酸化将非常重要。

我们仍然认为DNA测序是绝对的基础,需要执行来确定疾病状态,在癌症尤其如此。RNA-Seq是非常重要的补充方法,可提供以上信息,不仅是简单看看突变,而是尝试将其与药物匹配起来。

BLJ:如果您观察的是HER2拷贝数、HER2原位杂交荧光(FISH)率、或定量免疫组化(IHC),所有这些都与赫赛?。℉erceptin)有关并将从其受益。但是,当前的最佳标记位于转录组水平。在有磷酸肌醇-3激酶(PI3K)通路改变的肿瘤学案例中,我们的工作表明与活动的最佳关系位于磷酸化蛋白组水平,与DNA水平相反。因此,我们认为进一步深入转录组或蛋白水平会更好。我们与哥伦比亚的Andrea Califano合作,他研发出了已激活通路的转录组特征。通过从DNA上升至转录组特征,我们可以更多地了解癌症内部蛋白水平实际正在发生什么变化。

Q:您为什么使用测序而不是杂交的方法?

BY:十二年前,Brian和我开始使用Illumina芯片技术进行十年临床试验样本的回顾性分析。这个想法是回溯并对有反应的受试者与没有反应的受试者进行比较。当引入NGS后,我们开始使用HiSeq? 2500系统。我们也是在一项研究中最早使用TruSeq? RNA Access Library Prep Kit的团队之一?。

我们在芯片上分析了8000到10,000个样本,并使用RNA-Seq分析了几百个样本。其中一个重要问题是成本始终很高。如果正在运行400–500个样本,则测序全转录组的成本会更高。Illumina明白补充方法的价值,即可将DNA和RNA测序信息结合起来。研发TruSeq RNA Access的目的是使这些研究的实施更加经济实惠。

"如果您想有机会了解比我们现在所谓的“临床相关”更多的信息,并获取进行合作以及在以后回顾的额外信息,那么RNA-Seq就是正确的选择。"

Q:您是否将RNA-Seq的优势与基于杂交方法的优势进行了比较

BY:我们先假设什么都不知道,因此开展了平台比较研究来发现我们在数据类型、数据质量和使用不同平台的成本方面的知识差距。我们采集相同的临床样本集,并对在NextSeq 500系统上采用TruSeq RNA Access的RNA-Seq与NanoString nCounter直接杂交技术进行了比较。我们知道NanoString nCounter上每个样本的成本为开展RNA-Seq的一半。我们想要确定如果在两个平台上运行相同样本,是否可以获得相同的表达谱。

结果发现相关性非常高,在0.98–0.99范围内。因此,如果我们仅仅比较770-gene NanoString nCounter PanCancer Pathways Panel上的基因与TruSeq RNA Access转录组测序检测的相同基因,NanoString成本将较低,且这770个基因确定的表达谱相同。

然而,成本与覆盖范围又是另一回事了。将PanCancer Immune Profiling Panel和PanCancer Pathways Panel结合起来,我们获得了总共约1200个基因的转录组数据。这些组合PanCancer panel的成本与运行TruSeq RNA Access相同。但是,TruSeq RNA Access覆盖了这1200个基因以及另外20,000个参与这些通路的基因。通过该方法,可了解融合检出。

以相同的钱和相同的RNA起始材料,我们从TruSeq RNA Access所获取数据的丰度告诉我们选择Illumina平台会得到更多机会。如果您想有机会了解比我们现在所谓的“临床相关”更多的信息,并获取进行合作以及在以后回顾的额外信息,那么RNA-Seq就是正确的选择

Q:您为什么选择NextSeq 500系统?

BY:四年前我们建立拉霍亚测序实验室时,最初计划是使用HiSeq 2500系统。在那期间,Illumina发布了NextSeq 500系统。Brian和我评估了其规格和功能,最后决定采用NextSeq 500系统作为分子病理实验室的测序分析设备。这就是我们实验室选择NextSeq 500的原因。

Q:NextSeq 500系统能提供什么优势?

BY:以我们以前在核心研究所的经验,我们希望经济地使用HiSeq 2500系统的全部功能。我们一周可获得四、五或十个样本,在下周获得三个样本。需要八个样本才能装满HiSeq上的通道,但是当需要提供快速周转时,不能坐着等待样本积满一批再处理。我们意识到投资一个HiSeq系统上的价格能够运行两个独立的NextSeq系统。一个NextSeq系统可以运行DNA,另一个可以运行RNA,或者可以一起运行RNA和DNA,且不需要等到有大量样本。

因此,我们选择NextSeq 500系统的很大一部分原因是可根据获得的样本灵活匹配RNA和DNA测序设备的通量,以及提供快速周转的能力。此外,因为我们重点关注捕获技术和全转录组分析,对于全基因组测序没有很大需求。一些团队可真正从HiSeq 2500系统、甚至NovaSeq? 6000系统的高通量和成本效益中受惠。但是,像我们这样的实验室从NextSeq 500系统发现了更大的优势,该系统可提供快速周转以及经济实惠运行较少样本的能力。

"相同的钱和相同的RNA起始材料,我们从TruSeq RNA Access所获取数据的丰度告诉我们选择Illumina平台会得到更多机会。"

Q:您如何处理福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)保存的样本?

BY:那时,我们最初就开始处理这类样本,开玩笑说,我对提供这类样本的病理科真是又爱又恨。他们一直使用FFPE保存样本。我具有研究背景,希望得到原始的、新鲜冷冻的样本。过去五年,我们改进了自己的想法,明白了FFPE样本的价值。

通过FFPE保存,我们可以解决肿瘤异质性问题。病理学家可检查FFPE切片并确定肿瘤内容物最高的区域。我们可切取该特定部分用于分析,且还可从切片获得邻近正常组织并将其用作对照。

Q:FFPE样本的质量有提升吗?

BY:FFPE样本对于我们更可行的一个原因就是我们现在所处理FFPE样本的质量。与人们处理来自二十世纪六十年代、七十年代的较旧样本所面对的挑战而不同,我们通?;嵩诨罴觳杉囊桓鲈履谔崛NA和DNA。另外,我们现在使用的脱蜡方案更温和,能使更多RNA保持完整。我已经很久没有碰到样本严重降解到片段少于100个碱基对而无法进行分析的情况了。

使用TruSeq RNA Access,甚至是全转录组试剂盒,第一步通常是片段化RNA。FFPE保存会片段化RNA,为我们节省了一个检测步骤。我们常常发现提取RNA保存足够好,仍然需要进行片段化步骤。FFPE方案和Illumina文库制备试剂盒已有了发展,FFPE组织不再是什么挑战。

Q:您是否关注过区别肿瘤异质性的其他方法?

BY:我们已经涉足了激光捕获显微切割。通过激光捕获,技术良好的技术员可于一天内在几个样本上执行显微切割。细胞粘附到捕获膜上使得提取更加困难。执行标准显微切割不太有选择性。但是,好的病理学家可在5–10分钟内在苏木素和伊红(H & E)染色切片上圈出肿瘤部分。通过握有手术刀或刀片手动执行显微切割还需要一分钟。在手术切除情况下,我们切去不需要的部位来从标本的多个部分获得肿瘤内容物,而不是切取需要的部分。

随后便是需要进行多少深度测序的问题。这便是我们与信息学团队紧密合作的事项。我们希望确?;诩觳獠问芑竦镁】赡芏嗟乃鑢ead,以及有多少这些read定位到TruSeq RNA Access转录组序列。所有这些事项影响我们对检测本身以及可追踪该异质性的信心。从技术角度来讲,TruSeq RNA Access在最大程度发挥我们关注已知转录组的能力方面表现优异,以便我们从成本和数据方面获取最大益处。

"...我们选择NextSeq 500系统的很大一部分原因是可以根据获得的样本灵活匹配RNA和DNA测序设备的通量,以及提供快速周转的能力。"

Q:您是否考虑过执行单细胞测序来确定肿瘤异质性?

BY:我相信单细胞测序有独特的价值,但是我们还没有到可以经济地实施该测序的地步。其中一个问题是我们在100,000–500,000个细胞上执行RNA-Seq,约等于从病理切片上获取的细胞量。现在并无有效的方法可以从FFPE样本行制备那么多单个细胞。我看过单细胞数据,在解决异质性问题方面非常棒。但是,从肿瘤分析角度我们可以自信分离和测序的细胞绝对数量可能是个挑战。Brian和我始终关注新技术的研发、发布和改进。我们会期待该领域成熟,与此同时聚焦转化研究。

BLJ:当前,我们正在开展组织和血液的DNA靶向测序。我们通过这种组合的方法在一定程度上抵消了异质性。现在有几个团队正在组合开展循环肿瘤细胞(CTC)和游离DNA(cfDNA)分析。我们需要回答CTC、以及转录组学和蛋白组学适用于哪些应用的问题。我认为与在单细胞测序水平进行分析相比,这些是当前最重要的问题。

Q:未来,测序在癌症医学中的作用是什么?

BY:我们认为DNA测序将在五到十年内成为标准操作规范流程。我们认为RNA情况类似。

BLJ:在五年内,测序在癌症分析中将与传统放射学和病理学一样重要。这是一项正在快速整合到临床的技术。近期一次患者代表会议上,Kurzrock博士讲到在五年内如果医生不对癌症患者组织样本进行测序,则会认为是医疗差错。

我相信这些检测最终将在每个医院的分子病理实验室实施。就像我们现在在临床实验室中进行的生化和血液学检测系统一样,我认为将来在每个医院的分子病理实验室中都会有测序平台。引入TruSeq RNA Access就是为这种转变做准备。

由于我们这些年来的进步,人们正在从DNA测序分析转向转录组学和蛋白组学分析。某些类型的DNA水平靶向测序panel还将一直使用。但是,评估融合、microRNA和表达水平将变得更为重要。

我们感到在另一个五年内,Illumina平台会代表肿瘤学发展的方向。

 

了解有关本研究中所讨论的Illumina系统和产品的更多信息:

NextSeq 500系统,www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/nextseq.html

TruSeq RNA Access Library Prep Kit(当前称为TruSeq RNA Exome),www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/truseq-rna-access.html

HiSeq 2500系统,www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/hiseq-2500.html

NovaSeq 6000系统,www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html

参考文献
  1. 加州大学圣迭戈分校健康科学穆尔斯癌症中心研究和培训,Razelle Kurzrock(医学博士,资深副主任,临床科学)。www.healthsciences.ucsd.edu/research/moores/about/leadership/directors-office/Pages/clinical-science.aspx.Accessed September 19, 2017.

 

*美国国家癌症研究所治疗选择分子分析(NCI-Match)是一项精准医学癌症治疗临床试验。

?当前称为TruSeq RNA Exome


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